一、目的
學習藻類的分離和培養方法
二、藥品、材料和用具
水生生物培養槽，玻璃片（面積稍大於培養槽），橡皮管，顯微鏡，三角燒瓶，試管，篩絹，棉塞，微吸管，凹玻片，滅菌鍋，載玻片，吸管，培養皿，人工光源，木盆（或小型實驗池），充二氧化碳氣鋼瓶，抽氣幫浦，離心機。
土壤抽出液，青黴素，鏈霉素，瓊脂，硝酸鈣，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀，過磷酸鈣，硫酸鎂，氯化鉀，碳酸鈉，三氯化鐵，矽酸鈉，葡萄糖，蛋白 ，硫酸銨，硝酸銨，氯化鈣，碳酸氫鈉，鉬酸，氯化鈉，檸檬酸鐵，硫酸錳，人尿，海泥抽出液，食鹽。
三、操作
生長在靜水或水流緩慢河流中的藻類，培養比較容易。取到實驗室後，要立刻從材料瓶中移到寬大的水生生物培養槽內。為了培養大的絲狀藻，要利用寬的、不高的容器。這些容器要用玻片蓋住，以防止培養物受灰塵沾污。倒入容器的水要達到容器高度的一半，或稍多些，使水面上還有充分空氣。在容器邊緣，要用一小塊縱切橡皮管墊住，可使玻片不致緊貼容器，空氣才能進入容器中。細微的藻類如團藻目、矽藻門能很好地生活於培養皿中。很多藻類如顫藻屬、水綿屬的若干種、輪藻屬等可在實驗室中儲存很多年。
在迅速流動水中生長的藻如絲藻屬、毛枝藻屬等比較難於培養，因為它們要求經常輸入氧氣。在水層較高水中，在高容器中，這些藻類迅速地死亡。為了把這些藻類儲存到實驗時，應當把它們分成一些小部分，放在水層較薄的、寬的容器內，並須常常換水，把空氣吹入水中。還可以用橡皮管把水生生物培養槽和水龍頭連結起來，建立有流水的水生生物培養槽。
在水生生物培養槽中培養藻類時，應儘可能創造和保持藻類天然生存條件。把藻類培養在從采集藻類那一水域取來的水中，或其他天然水（尤其不能用自來水，因其中含很多氯氣，必要的話，也須置較長時間，或加以煮開），或在水中加入混合養料，這些養料是由製造有機物質所必需的礦質鹽構成。
在夏季，不要把藻類培養物放在直射太陽光下，而要放在涼爽的場所，例如向北窗台上。在秋、冬季節，如希望藻類保持積極生活活動狀態，就要把培養物移到有人工光照處。
以上是一般藻類粗放的培養、儲存方法。如要作較深入實驗，需注意以下問題︰
1．藻種的分離
藻類培養首先要有藻種。從天然水域的混雜生物群中，用一定方法把所需藻類個體分離出來，而獲純種培養。這種方法稱為藻種分離和純化，又稱純培養法。
真正的“純種培養”是指在排除包括細菌在內的一切生物的條件下進行的培養。這是進行科學研究不可缺少的技術，而在生產性培養中不排除細菌的稱之為“單種培養”。
（1）采樣和預備培養︰首先要采集有需要分離藻類的水樣，采回後在顯微鏡下檢查。如發現需要分離的藻類數量較多時，可立即分離。若數量很少，最好先進行預備培養，待其增多後，再分離。
用作預備培養的培養液，各種藻類是不同的，對一些難以培養的藻類一般加入土壤抽出液較好。預備培養液營養成分濃度應小些，一般只有原配方的1/4～1/2。如水樣中藻類種類較多，就應使用幾種不同的培養液，使藻類在適合於自己繁殖的培養液中繁殖起來。
可用三角燒瓶或試管作培養容器，加入容量1/4～1/3培養液。然後把經篩絹過濾除去大型浮游生物的水樣接種進去，放在合適溫度下或室內靠北視窗下培養。在培養附著藻類時，容器可靜止不動；而培養浮游藻類時，應該每天搖動一次。
有的藻類在普通培養液中完全不能繁殖，有的繁殖非常困難。此時需改變培養液濃度，加入葡萄糖、蛋白 等有機物，補充微量元素和輔助生長物質，加入土壤抽出液，就有可能獲較好效果。
土壤抽出液製作方法︰先在試管底部，加入高約1cm土壤（採用腐殖化的農田和庭院土）。再加入水使達5cm，塞上棉塞，採用蒸氣間隙滅菌，每天滅菌1小時，連續二天。由於氣泡上升，棉塞可能弄髒。因此，最好先在水中煮一段時間，使氣泡跑掉後，再加棉塞進行滅菌。
（2）分離方法︰常用下列四種。
1）微吸管（毛細管）分離選直徑較細（約5毫米）玻管，在火焰上加熱，待快熔時，快速拉成口徑極細的微吸管。將稀釋適度藻液水樣，置淺凹載玻片上，鏡檢。用微吸管挑選要分離的藻體，認真仔細地吸出，放入另一淺凹載片上，鏡檢這一滴水中是否達到純分離的目的。如不成功，應反覆幾次，直至達到分離目的為止。然後移入經滅菌的培養液中培養，一般在每個培養皿中接20～30個個體。從分離出少量細胞擴大培養到200毫升的培養量，如矽藻一般需20天以上。為了較長時期儲存藻種，可將分離到的藻種用青黴素（1000～5000單位或鏈霉素（20ppm）處理後，獲得較純藻種。
此法操作技術要求高，要細心。往往吸取一個細胞，要反覆幾次才能成功，且適於分離個體較大藻類。
2）水滴分離法用微吸管吸取稀釋適度藻液，滴到消毒過載片上，水滴儘可能滴小些，要求在低倍鏡視野中能看到水滴全部或大部分。一個載片上滴2～4滴，間隔一定距離，作直線排列。如一滴水中只有幾個所需同種藻類個體，無其他生物混雜，即用吸管吸取培養液，把這滴水沖入裝有培養液並經滅菌試管或小三角瓶中去。如未成功，需反覆重做，直到達到目的。
此法簡便易行，尤其適宜於分離已在培養液中佔優勢種類。分離受少量生物污染培養液中的藻類多用此法。操作時同樣要求細致、認真，使用工具及培養液經嚴格消毒。
3）稀釋分離法把含有需要分離的藻類而又混雜有其他生物的水樣，取其一定量，用培養液稀釋。透過稀釋到適宜程度的方法，達到把原混雜生物單個分離培養的目的。
首先把水樣稀釋到每一滴含有一個左右的生物細胞（也可能一個都沒有，也可能有兩個），在稀釋過程中配合顯微鏡檢查，調節稀釋度，然後準備裝有1/4容量培養液的試管20支，每一試管加入稀釋適宜水樣一滴，搖勻，進行培養。待藻類生長繁殖達一定濃度時，再檢查是否達到分離目的，若未達到，再重複做。
此法操作簡單易行，但有一定程度盲目性，比不上水滴分離法效果好。
4）平板分離法這個方法的培養基製備和分離方法，與菌類的平板分離法基本相同，只是培養基配方不同。也可將稀釋藻液裝入消毒過的小型噴霧器中（可使用醫用喉頭噴霧器），打開培養皿蓋，把藻液噴射在培養基平面上，形成分佈均勻的薄層水珠。
接種後，蓋上蓋，放在適宜的光、溫條件下培養。一般經過十余天，就可在培養基上發生互相隔離的藻類群落，透過顯微鏡檢查，尋找需要的純藻群落，然後用消毒過的接種環移植到另一平板培養基培養，也可直接移植到裝有培養液並經過滅菌的試管或小三角燒瓶中，加消毒棉花塞子，進行培養。
此法較繁，但難度不大，而且可看到是否污染雜菌，對於分離已污染雜菌培養液的藻類更合適。
5）底棲藻的分離在顯微鏡或放大鏡下挑取個體，一般可接種在固體培養基平板上，反覆挑選、培養。
6）分離浮游藍藻可利用其浮力大，易浮起在水面的特性；分離矽藻則可利用其易沈澱的特性。
用以上各種方法分離到藻種，需放在適宜光照條件下（靠南或北視窗附近光線充足處，但嚴防陽光直射）培養，有條件的可控制溫度和利用人工光源。培養時，每天輕輕搖動1～2次，但需注意勿把培養液沾濕棉塞，避免雜菌污染。經一段時間後，培養物顏色逐漸變深。再經一次顯微鏡檢查，如無其他混雜生物，才達到單種培養目的。
2．藻種的培養
獲得單種培養後，一方面擴大培養，另一方面可把藻種作較長時間儲存，需要時隨時取出使用。藻種培養要求比較嚴格，培養容器可用各種不同大小的三角燒瓶，容量有100、300、500、1000毫升，適於逐漸擴大培養。培養容器和工具需經煮沸滅菌或使用化學藥品滅菌後，用煮沸水沖洗，培養液用加熱滅菌法滅菌。按種後瓶口用滅菌紙包紮，放在適宜光、溫條件下培養，每天輕輕搖動二次。大約二周後進行一次移植。藻種在培養過程中必須定期用顯微鏡檢查，保持不受其他生物污染。
3．藻種的保藏
可接在固體培養基上，在常溫、弱光下保藏半年到一年；也可在低溫下（雪櫃內）保藏，每天接受短時間（幾個小時）弱光，可保藏2～3年；如不照光，只能保藏幾個月。保藏藻種所用培養基的營養成分濃度應比正常培養基高一些，一般可增加一倍，瓊脂量為1～1.5％。也可在固體培養基上，再加培養液，然後接種到培養液中，可以避免固體培養基乾涸，保藏效果比單用固體好。
4．培養液和培養基的配方
配方極多，每種配方主要適用於一定藻種，這裡介紹比較常用的幾種︰
水生4號和克諾普（Knop）培養液，一般用於綠藻；藍藻可用朱氏10號或水生105號無氮培養基（後者適於固氮藍藻）；矽藻可用朱氏10號和水生矽1號培養基；另外還有海產綠藻、矽藻的培養基。常用培養基配方見表1。
以上用水量都是加至1000mL，海藻培養液用海水，如無海水可用淡水1000mL加30克食鹽代替。土壤抽出液用菜園土1份和水2份比例混合攪勻，靜置，取上清液；海泥抽出液也可用同樣比例製備。如配製固體培養基，可在培養液內加入1.5％瓊脂。
從以上各種配方，可看到配製藻類培養液的幾條原則︰
（1）要有適量氮源（除固氮藍藻外），如氨鹽、硝酸鹽、有機氮等。
（2）應包括主要元素鉀、磷、鎂、硫、鈣等。
（3）要考慮各種鹽類總濃度和pH是否適合藻類需要，可用碳酸氫鈉調節pH。
（4）要加入各種藻類需要的微量元素，如鐵、錳、銅、鋅等（後幾種包括在土壤抽出液中）。
（5）要滿足某些藻類特殊需要，如藍藻需鉬，矽藻需矽。
（6）要添加適量生長物質如維生索B1、B2等（包括在土壤抽出液中）。
5．大量培養過程
包拈接種、培養、采收等。
（1）接種︰一般要求選取生活力強、生長旺盛藻種。可先將濃縮藻種用連續稀釋法，製備一定濃度的懸浮藻液，然後接入培養容器。接種時注意藻種和培養液比例要適當，使藻細胞在新培養液中達到一定數量。使一開始培養，藻類在培養液中佔優勢，另一方面還可縮短培養週期，這是培養得到成功的經驗之一。在環境條件不很適合情況下，更需提升接種量。一般所用藻種濃度，根據藻類體積大小，每毫升30萬～300萬個，採用1：2～1：5的比例。還需注意接種時間，在自然光條件下，最好在上午8～10時，不宜在晚上。尤其是能運動種類，此時明顯向上浮游，接種時可把上浮優質藻類吸出做藻種，起選種作用。
（2）培養管理︰主要是使已接種培養物在相對穩定適宜環境中大量繁殖生長。要注意以下原素︰
1）二氧化碳濃度在開放式不通氣方法培養中，攪拌是十分必要的，可以增加水和空氣的接觸面，使空氣中二氧化碳溶解到培養液中，而且幫助沈澱藻類細胞上浮獲得光照。在通氣培養中，培養液內應維持二氧化碳濃度在0.1～5％之間。
2）光照強度利用太陽光源培養時，一般在室內培養可放在近視窗地方，防止強直射光照射。或利用人工光源（60～100瓦電燈或日光燈），需1500～3000勒克斯/厘米2。
3）溫度適溫一般在10～30℃之間，最適溫常為20～25℃。若在室外培養，夏季中午高溫，冬季早晚低溫，常造成不利影響，需設法調節。
4）無機營養應不斷添加新鮮培養液，及時補充被藻吸收後減少了的某些元素。
5）注意pH變化如變動過大，可用酸、鹼調節。
6）適當控制培養物中藻細胞濃度過高會引起光照和無機營養不足，並導致pH上升。一般控制在0.3g（干重）/L範圍內。
7）及時觀察和檢查藻類生長情況可以透過培養物呈現的顏色、藻類細胞運動情況、是否有沈澱附壁、菌膜及敵害生物污染跡象等觀察而了解一般的生長情況。藻種和中繼培養每半月進行一次全面顯微鏡檢查。大量培養中發現有不正常現象，應立即鏡檢，目的有兩個︰了解藻細胞生長情況，並檢查有無敵害生物污染。
（3）采收︰培養液中藻體的適時采收，既是培養的目的，也是繼續培養的手段。因為透過采收一部分藻體，可使藻細胞濃度保持恆定。通常在培養物細胞濃度達到干重0.4～0.5克/升時，即可采收培養總量1/3的藻體。
采收時，先攪拌培養物，取出1/3量藻液，置於沈澱缸中，加入2％～3％明礬或6％飽和鍛石水。約1～2小時，藻細胞即可完全沈澱，取出沈澱，離心、濃縮、烘干。在大型培養池中采收藻體，可另外設計適當的工藝流程
轉載
用於研究交流如有冒犯敬請指正刪除
沒有留言:
張貼留言
私密留言請至右側欄位最下方"私密留言專區"